在微生物內進行蛋白質表達是生物科技中的核心技術。然而，每種蛋白質都具有其獨特的結構性質，比如二硫鍵（disulfide bonds）數量，是否存在疏水區域 (hydrophobic regions)，是否存在跨膜區域 (transmembrane domains)，是否具有糖基化 (glycosylations) 等翻譯后修飾過程等， 所有的這些性質都可能決定著蛋白質表達過程的難易。在與目的蛋白質來源相似的宿主內表達蛋白質要相對容易些。然而，大多時候，我們需要在與蛋白質來源不同的宿主內進行蛋白質的表達，比如在原核細胞內表達真核生物的蛋白質，這通常是具有挑戰性的。在這里，小編與大家分享幾個有助于跨系統實現蛋白質表達的工具。
 
1. 密碼子優化
為了理解密碼子優化(codon optimization)的重要性，我們需要首先知道什么是密碼子優化。簡單來講，就是在我們構建的載體內引入宿主系統tRNA更愿意讀取的密碼子，這樣能夠更容易將其翻譯成氨基酸，這會提高翻譯速度，提高蛋白質表達的效率。沒錯，我這里用了“更愿意”這樣一個主觀性很強的詞。實際中確實是這樣的，生物系統是具有密碼子偏好性的，不論真核生物還是原核生物，每種生物都會表現出某種程度的密碼子利用的差異和偏愛。這是因為不同生物系統對于特定的密碼子具有不同數量的可利用的tRNAs，并且每一個系統內對于每一個密碼子，都有特定數量的tRNAs。所以，如果tRNAs與密碼子數量的比例不正確，就會阻礙蛋白質的表達。因此，在進行蛋白質表達前，需要根據表達系統，對目的基因進行密碼子優化，使用宿主系統內存在的tRNAs更偏好的密碼子。
 
2. 純化標簽
當我們在微生物內進行蛋白質的表達時，最后通常都是要對蛋白質進行純化的。當然，如果你只是為了應用全細胞提取物或者裂解提取物，可以不用考慮蛋白質的純化問題。為了實現蛋白質的純化，我們必須為蛋白質加上純化標簽。目前很多純化標簽已經被系統研究并應用于實踐了，常用的純化標簽包括His tag， Strep-II tag， GST， Flat-Tag等。
 
3. 分子伴侶與折疊酶
表達一個困難的基因就像砸碎一個硬堅果，有時候你需要借助外力。為了獲得一個有用的蛋白，很重要的一點就是保證蛋白質正確折疊。細胞質（cytoplasm）的環境還原性(reducing)的，這不利于二硫鍵的正確形成，因此會影響蛋白質的折疊。為了輔助蛋白質正確的折疊，防止形成不可溶的包涵體，我們需要表達分子伴侶(chaperones)和折疊酶(foldases)的輔助載體。一些常見的分子伴侶和折疊酶包括DsbA/C, Skp, FkpA, GroEL/ES, DnaK/J/GrpE等。我們可以根據蛋白質的表達位置，選擇細胞質（cytoplasmic）內分子伴侶或者細胞間質（periplasmic）分子伴侶。另外一些標簽也能夠輔助蛋白質的折疊，比如麥芽糖結合蛋白（maltose binding protein, MBP）。MBP是一個42.5 KDa的蛋白質，能夠與目的蛋白質融合表達，不僅能夠增加蛋白質的可溶性，還能夠輔助蛋白質折疊。MBP的另一個優勢是能夠與交聯淀粉柱（amylose column）結合實現目標蛋白的純化。
 
4. 蛋白質表達位置
在實驗之前，我們需要考慮蛋白質在哪里表達，是細胞質內（cytoplasm），細胞間質（periplasm）還是細胞外(extracellular)分泌表達。如果一個蛋白質內包含有二硫鍵，我們最好在細胞間質的氧化環境內令其表達。氧化環境能夠幫助蛋白質形成正確的二硫鍵從而獲得正確的結構。如果想要蛋白質在細胞內特定的位置表達或分泌到細胞外，需在蛋白質的N端添加信號肽。在信號肽的幫助下，蛋白質能夠轉移到特定的位置。例如，來自果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）內的PelB信號肽能夠引導蛋白質進入到革蘭氏陰性菌（gram-negative）的細胞間質中。再比如，來自變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）內的信號肽能夠將使蛋白質分泌表達到培養基之中。
 
5. 蛋白質表達通路
蛋白質分泌表達具有很多的優勢。一方面分泌表達蛋白質能夠減少對宿主菌的毒性和代謝負擔，使菌適應性增加；另一方面周質空間和胞外培養基中宿主菌蛋白含量很低，有利于目的蛋白的純化。不同的表達途徑對蛋白質的折疊效率有很大的影響。革蘭氏陰性菌共分為5種天然分泌系統，即I型，II型，III型，IV型和V型。 E.coli 主要通過I型和II型系統分泌表達蛋白質。Ⅰ型分泌系統通過α-溶血素途徑直接介導胞外分泌，組成元件簡單，外源重組蛋白與HlyAC-端結合后，再與HlyB/HlyD形成復合物，由ATP水解提供能量，通過TolC通路實現胞外分泌。通過該系統分泌出胞外的蛋白C端仍然帶有一段信號序列，需要在體外進行剪切;此外該系統中的一些共表達部件對目的蛋白的轉運有競爭作用，重組蛋白表達量很低。Ⅱ型分泌系統先介導細胞周質分泌，再經過MTB(main terminal branch)機制實現胞外分泌。分泌蛋白利用以下三種途徑透過細胞質膜: Sec (secretion)通路、信號識別顆粒(signal recognition particle, SRP)通路或雙精氨酸轉移(twin arginine translocation, TAT)通路。三種通路有所不同，Sec通路將蛋白質轉移到周質空間后蛋白質進行折疊，TAT通路卻是將折疊后的蛋白質轉移到細胞周質，而SRP途徑允許蛋白質同時進行折疊與轉移的過程[1]。由于Ecoli跨越內膜的轉運裝置不完善，蛋白輸出能力不夠,蛋白酶降解等原因導致分泌效率低，胞外分泌量往往達不到實驗或工業生產的要求，目前大腸桿菌的分泌主要是指重組蛋白通過Ⅰ或Ⅱ型系統透過胞質膜分泌至周質腔。
 
6. 表達菌株
不同的大腸桿菌菌株在培養條件和外源基因表達能力上存在著很大差別，因此不同宿主菌的選擇對表達產物的積累以及下游分離純化有至關重要的作用。利用蛋白酶表達缺陷的突變菌株可以提高重組蛋白的分泌表達量,一些缺陷性菌株(如合成外膜元件的基因突變體)既能夠產生可溶性的、具有正確空間結構和二硫鍵的活性蛋白，又能夠避免細胞壁在外源蛋白跨膜轉運中的阻礙作用，有利于重組蛋白分泌到培養基中。最成功的例子就是L2型細菌(缺乏細胞壁和胞周質)已用于青霉素酰基轉移酶、鏈激酶、微小抗體的分泌表達中。但因為這些菌株有生長受損性，不能耐受高密度發酵的過程，L2型細菌不適合工業化生產。
 
7. 培養基，溫度，誘導條件等因素
培養基成分、培養方式、培養條件及培養過程中抑制性代謝產物的積累等都會影響重組蛋白在工程菌中的表達產量和分泌的量。其中培養基營養成分、pH和溫度等參數是影響工程菌生長和表達外源蛋白的重要因素,能夠影響蛋白酶的活性、分泌和表達水平。向培養基中添加甘氨酸可以在不導致菌體自溶的情況下促進蛋白從周質空間向胞外的分泌,且不引起明顯的細菌裂解。在培養基中添加糖膠和TritonX-100能阻止周間腔中包涵體的形成，并提高胞外表達的效率。改變培養基的滲透壓、短時間的熱沖擊誘導及降低誘導時的溫度,會明顯提高重組蛋白在大腸桿菌的可溶性表達。另外，對于需要IPTG誘導的菌株，誘導時刻，溫度及培養時間必須經過優化。
 
8. 細胞培養時間
合適的細胞培養時間是決定著細胞完整度及蛋白質表達水平的一個重要因素。細胞培養時間過長會導致細胞裂解，目的蛋白丟失，有毒蛋白酶釋放。而細胞培養時間太短的直接后果就是細胞濃度不夠，目標蛋白產率太低。因此重組菌株的培養時間必須經過優化。

素材來源于網絡。
想了解更多生化試劑知識，敬請關注“匯百試劑”官方網站：http://m.366gww.com
(本網站所有內容，凡注明來源為“匯百試劑”，版權均歸匯百試劑所有，未經授權，任何媒體、網站或個人不得轉載，否則將追究法律責任，授權轉載時須注明“來源：匯百試劑”。本網注明來源為其他媒體的內容為轉載，轉載僅作觀點分享，版權歸原作者所有，如有侵犯版權，請及時聯系我們。)